Spectrophotométrie UV-Visible :

 

  

Spectrophotomètre UV-Visible de laboratoire

 

Principe

 

En spectrophotométrie UV-Visible, on fait arriver un faisceau lumineux quasi monochromatique sur un échantillon à analyser, et on vient mesurer l'intensité lumineuse I qui a réussi à traverser l'échantillon.

 

Cette technique est très utilisée en chimie : l'échantillon est alors mis en solution et contenu dans une cuve.

Bien que semblant être transparents, la cuve comme le solvant absorbent toujours une partie de la lumière incidente. Pour n'avoir que la mesure concernant l'échantillon, il faut "décompter" l'effet du à la cuve et au solvant. On réalise donc une autre mesure : celle du "blanc", en faisant passer le faisceau lumineux à travers la même cuve contenant cette fois que du solvant :

Cette mesure est toujours réalisée avant celle de l'échantillon.

(On ne laissera pas une durée trop grande entre les deux mesures pour limiter les erreurs de dérive de l'instrument)

L'intensité lumineuse I₀ du faisceau qui a traversé ce "blanc" est supérieure à I.

On définit alors l'absorbance de l'échantillon par la relation :

Remarques :

• La définition de l'absorbance fait apparaître l'utilisation du logarithme décimal. Cette fonction mathématique "écrase" les valeurs : log(10) = 1  ;  log(100) = 2  ; log(1000) = 3.  En conséquence : une absorbance augmentée de 1 c'est une intensité I dix fois plus faible qui ressort de la cuve

 

• comme indiqué sur les schémas, on réalise généralement une conversion intensité lumineuse →tension électrique à l'aide d'une photodiode (le capteur de lumière) suivie d'un montage électronique. L'absorbance est alors calculée à partir des tensions mesurées par la relation :

• Le résultat obtenu n'a de sens que si l'intensité lumineuse incidente est rigoureusement la même lors des deux mesures ! Cela impose des contraintes :
  • pour le constructeur : bien stabiliser l'alimentation électrique ainsi que la température de la source de lumière
  • pour l'utilisateur : mettre en fonctionnement le spectrophotomètre pendant quelques minutes avant de commencer à faire des mesures

Ci-dessous la face arrière de l'appareil utilisé au lycée :

la source de lumière est placée à l'extérieur pour stabiliser sa température,

mais aussi pour éviter de faire chauffer l'électronique de mesure ainsi que l'échantillon mesuré

 

 

Types de mesures

L'utilisation d'un spectrophotomètre UV-Visible permet deux types de mesures :

1- La réalisation d'un spectre d'absorbance :

On relève l'absorbance de l'échantillon pour différentes longueurs d'ondes.

On obtient une courbe A = f (λ) appelée spectre d'absorbance de l'échantillon

Ci-dessous le spectre d'absorbance du permanganate de potassium (en solution dans de l'eau). L'absorbance est grande dans le vert, mais faible dans le bleu et le rouge, d'où la teinte violette perçue par l'oeil lorsque l'on regarde une telle solution par transparence

2- La réalisation d'un dosage par étalonnage :

Dans un dosage par étalonnage, on fixe la longueur d'onde de travail et on change la concentration C de la solution étudiée de façon à obtenir une courbe d'étalonnage A = f(C)

Une fois cette courbe obtenue, on peut obtenir la concentration d'une solution inconnue mais de même nature que les échantillons :

Pour être la plus précise possible, cette manipulation se réalise en principe en réglant le spectrophotomètre sur une valeur de longueur d'onde correspondant à un pic d'absorbance relevé sur le spectre d'absorbance de l'échantillon. En effet, c'est pour cette longueur d'onde que la sensibilité du dispositif sera la plus grande.

Par ailleurs, sur un pic d'absorbance, nous sommes sur un extremum : en un tel point on a la dérivée qui est nulle ou très faible :

En conséquence, une faible variation de λ en cours des mesures n'entraîne qu'une très faible variation de l'absorbance A. Il en serait tout autrement si on réglait le spectrophotomètre à une longueur d'onde située dans la pente du pic : là une petite variation de λ (suite à des vibrations mécaniques par exemple) entraînerait une forte variation de A. (Cette remarque est pertinente pour les spectrophotomètres dont le réglage de la longueur d'onde se fait mécaniquement)

 

Technologies

La conception des spectrophotomètres UV-Visible repose actuellement sur l'une des deux techniques suivantes :

1- Spectrophotomètre à système dispersif mobile :

Une source de lumière blanche (une lampe à filament) éclaire un système dispersif (le plus souvent un réseau) qui peut tourner. Le spectre obtenu est projeté sur une plaque percée d'un orifice. Selon l'orientation du réseau, on laisse passer une radiation bien particulière du spectre :

La rotation du réseau était manuelle sur les anciens modèles. Aujourd'hui ele est réalisée par un moteur pas à pas piloté électroniquement :

• par un clavier numérique qui permet d'entrer la longueur d'onde souhaitée :

• par un ordinateur relié au spectrophotomètre :

Sur les modèles à faisceau unique comme celui présenté ici, on doit faire la mesure du "blanc" puis la mesure de l'échantillon.

Sur les modèles à double faisceau (comme présenté sur la simulation ci-dessous (site ostralo.net) :

le faisceau est divisé en deux ce qui permet de faire simultanément le blanc et la mesure de l'échantillon (mais la cuve pour le blanc est différente de celle de l'échantillon)

2- Les spectrophotomètres à système dispersif fixe :

Ces appareils sont de conception plus récente : le spectre obtenu avec un système dispersif fixe (par exemple un réseau) est projeté sur une barrette CCD constituée de plusieurs centaines de pixels sensibles à la lumière (c'est l'équivalent d'un capteur d'appareil photo numérique mais sur une seule dimension au lieu de deux) :

 

On remarque que dans ce type d'appareil, l'échantillon est traversé par un faisceau de lumière blanche et non plus par un faisceau monochromatique car la décomposition de la lumière est réalisée en aval de l'échantillon et non plus en amont comme dans les spectrophotomètres classiques.

Là aussi il y a nécessité de réaliser un"blanc" avant de faire la mesure sur l'échantillon.

La récupération du spectre d'absorbance A = f(λ) est quasiment instantanée, contrairement à ce qui se passe avec les spectrophotomètres décrits au premier paragraphe.

C'est ce même principe qui est mis en oeuvre dans les spectromètres à fibre optique :

Pour récupérer l'absorbance à une longueur d'onde donnée, on demande au logiciel de transmettre la mesure faite par le pixel de la barrette sur lequel arrive la longueur d'onde concernée.

Un avantage de ces instruments c'est l'absence de pièces en mouvement ce qui limite les risques de déréglages en cours de transport

 

Utilisation

Le spectrophotomètre décrit ici est le Secomam Prim Light.

1- Manipulation des cuves

Les cuves standard ont un "trajet optique" de 1,0 cm mais peuvent avoir des aspects différents :

        

On trouve des cuves :

• avec 4 faces claires
• avec deux faces claires et deux faces floues (celle de doite sur la photo)
• avec deux faces claires mais une forme réduite dans la partie inférieure pour limiter la quantité de solution nécessaire (celle de gauche sur la photo)

 

• Le faisceau lumineux devra toujours traverser les faces claires de la cuve, et ces faces devront être parfaitement propres.
• Le faisceau traverse la partie inférieure de la cuve : la cuve sera manipulée par sa partie haute (ou éventuellement par les faces floues)
• On ne remplit pas la cuve à ras bord (risque de débord dans l'appareil) : on arrête le remplissage au niveau du repère supérieur (à environ 1 cm du haut de la cuve) ...
• Au niveau du porte-cuve du spectrophotomètre, une flèche indique le sens du faisceau lumineux ce qui permet de positionner les faces claires de la cuve du bon côté
• La cuve doit être placée bien verticale dans le porte-cuve pour que le trajet optique soit correct (identique pour le blanc et pour l'échantillon)

2- Utilisation du spectrophotomètre en mode manuel :

Ce mode n'est pas du tout adapté au relevé d'un spectre d'absorbance A = f(λ) car ce serait trop long et trop fastidieux : plusieurs centaines de mesures alternées blanc et échantillon pour avoir un spectre bien défini !!!

On le réservera pour la mesure d'absorbance à longueur d'onde fixée (par exemple dans un dosage par étalonnage)

Télécharger la fiche ci-dessous : c'est celle que l'on fournit lors des ECE

3- Utilisation du spectrophotomètre en mode piloté :

Ce mode permet de piloter le spectrophotomètre par ordinateur. Le logiciel Atelier Scientifique sait gérer le spectrophotomètre PrimLight.

Ce mode est particulièrement bien adapté aux mesures répétitives telles que :

• la réalisation d'un spectre d'absorbance
• la réalisation d'un suivi cinétique

Le spectrophotomètre doit être connecté au PC par un câble RS232 (+ un câble de conversion USB - RS232 si le PC n'a pas de port série).

Avant de lancer le logiciel le spectrophotomètre doit être éteint

Ci-dessous : une fiche pour apprendre à réaliser un spectre d'absorbance A = f(λ) :

 

Ci-dessous une fiche pour apprendre à réaliser un suivi cinétique A = f(t) :

Caractéristiques du PrimLight

 

La gamme spectrale de cet appareil nous montre qu'il est capable de travailler dans le visible et un peu au delà dans l'ultra-violet et dans le début des infra-rouges. Ce type d'appareil est parfois appelé UV-VIS pour UV-Visible. On ne spécifie pas IR pour ne pas avoir de confusion avec la "vraie" spectroscopie infra-rouge

Stratégies de manipulations

 

1- Je dois analyser le contenu d'un échantillon :

• c'est la comparaison du spectre d'absorbance A = f(λ) de l'échantillon avec des spectres d'absorbance de référence qui me permet de répondre au problème :
  • je réalise le spectre d'absorbance de mon échantillon (qui peut être un corps pur ou un mélange)
  • je le compare avec des spectres de références :
    • que j'ai déja dans mes archives
    • sinon j'en réalise avec une ou des solutions de corps purs susceptibles d'être contenus dans l'échantillon à analyser. Des informations sur la provenance de l'échantillon ou sa couleur peuvent m'aiguiller vers telle ou telle espèce de référence  à tester
    • Rque : si ces solutions de référence n'existent pas, il faut les réaliser. Peut-être par dissolution ou bien par dilution (si la concentration trop grande à disposition fait saturer le spectrophotomètre)

 

2- Je dois faire un dosage par étalonnage :

• il faut connaître la longueur d'onde idéale de travail, en principe celle d'un pic caractéristique du spectre A = f(λ) :
  • j'ai déjà ce spectre dans mes archives : je l'utilise
  • sinon je dois faire ce spectre :
    • revoir la fiche correspondante si nécessaire.
    • il me faudra une solution de l'espèce à étudier
• je réalise mes solutions étalon
  • Le volume nécessaire étant faible, on les réalise dans des tubes à essais :
    • revoir la page 2 de cette fiche si nécessaire
• je mesure l'absorbance de ces solutions (sans oublier celle de l'échantillon !) avec le spectrophotomètre en mode autonome
• je trace la courbe d'étalonnage ; la mesure de l'absorbance de l'échantillon inconnu me permet de trouver la valeur de sa concentration

3- Je dois faire un suivi cinétique :

• je choisis de travailler sur l'un des produits ou l'un des réactifs de la réaction

• il faut connaître la longueur d'onde idéale de travail, en principe celle d'un pic caractéristique du spectre A = f(λ) de l'espèce choisie:
  • j'ai déjà ce spectre dans mes archives : je l'utilise
  • sinon je dois faire ce spectre :
    • revoir la fiche correspondante si nécessaire.
    • il me faudra une solution de l'espèce à étudier
• je mesure l'absorbance au cours du temps du mélange réactionnel